酶底物法檢測包裝飲用水中銅綠假單胞菌方法研究
銅綠假單胞菌，又稱綠膿桿菌，屬于假單胞菌屬，是一種重要的食源性和水源性致病菌，在水中分布廣泛，在特定情況下可引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和胃腸道等多種急性和慢性感染及敗血癥。國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 包裝飲用水》（GB 19298-2014）規(guī)定，包裝飲用水中銅綠假單胞菌不得檢出。然而，研究表明，市售包裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染屢見不鮮，因此，有效監(jiān)控包裝飲用水中銅綠假單胞菌對于保障居民飲水安全有重要意義。
目前，銅綠假單胞菌國內(nèi)檢測標(biāo)準(zhǔn)是《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016），此方法為濾膜法，但在實際應(yīng)用中存在檢測周期長、操作過程復(fù)雜等局限性。我公司第一個成功申請并發(fā)布的團體標(biāo)準(zhǔn)《包裝飲用水中銅綠假單胞菌的測定 酶底物法》（T/HBFIA 0026—2021），可在24h內(nèi)定性或定量檢測包裝飲用水中的銅綠假單胞菌，操作簡單，無需確認(rèn)實驗，可以很好地彌補濾膜法在檢測過程中的不足。
一、材料和方法
（一）試劑與設(shè)備
依據(jù)相關(guān)方法要求準(zhǔn)備相應(yīng)的試劑與設(shè)備。
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1. 濾膜法
濾膜法檢測步驟參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）進行檢測。
2. 酶底物法
酶底物法檢測步驟參照《包裝飲用水中銅綠假單胞菌的測定 酶底物法》（T/HBFIA 0026—2021）進行檢測。
3. 定量質(zhì)控檢測
NSI定量質(zhì)控菌株從-10℃冰箱取出，首先在室溫下平衡溫度10min—15min，隨后將質(zhì)控菌株轉(zhuǎn)移入預(yù)先準(zhǔn)備好的250mL無菌磷酸緩沖液中，輕輕振蕩，直至質(zhì)控菌株完全溶解。注意水合作用30min內(nèi)完成檢測。
二、實驗結(jié)果分析和討論
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目前，銅綠假單胞菌國內(nèi)檢測標(biāo)準(zhǔn)是《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016），此方法為濾膜法，但在實際應(yīng)用中存在檢測周期長、操作過程復(fù)雜等局限性。我公司第一個成功申請并發(fā)布的團體標(biāo)準(zhǔn)《包裝飲用水中銅綠假單胞菌的測定 酶底物法》（T/HBFIA 0026—2021），可在24h內(nèi)定性或定量檢測包裝飲用水中的銅綠假單胞菌，操作簡單，無需確認(rèn)實驗，可以很好地彌補濾膜法在檢測過程中的不足。
一、材料和方法
（一）試劑與設(shè)備
依據(jù)相關(guān)方法要求準(zhǔn)備相應(yīng)的試劑與設(shè)備。
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1. 濾膜法
濾膜法檢測步驟參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）進行檢測。
2. 酶底物法
酶底物法檢測步驟參照《包裝飲用水中銅綠假單胞菌的測定 酶底物法》（T/HBFIA 0026—2021）進行檢測。
3. 定量質(zhì)控檢測
NSI定量質(zhì)控菌株從-10℃冰箱取出，首先在室溫下平衡溫度10min—15min，隨后將質(zhì)控菌株轉(zhuǎn)移入預(yù)先準(zhǔn)備好的250mL無菌磷酸緩沖液中，輕輕振蕩，直至質(zhì)控菌株完全溶解。注意水合作用30min內(nèi)完成檢測。
二、實驗結(jié)果分析和討論
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選擇中國工業(yè)菌種保藏中心（CICC）的銅綠假單胞菌菌株，溯源信息為CICC21636，按照廠家提供的制備方法，將其稀釋至適宜的濃度制備成高、中、低3種濃度的人為污染樣品，使用酶底物法進行測定銅綠假單胞菌，每個濃度分別重復(fù)測定7次。為了使檢測結(jié)果呈正態(tài)分布，將檢測結(jié)果作對數(shù)處理后再進行方法精密度的計算，結(jié)果表明：高、中、低3種濃度樣品的實驗室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.3%、0.8%和9.0%。酶底物法檢測高、中、低不同濃度樣品的實驗室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi)，方法的穩(wěn)定性很高。
?。ǘ┓椒ㄕ_度
選擇NSI銅綠假單胞菌定量質(zhì)控（批號：210414，真值范圍168±24MPN/250mL），使用酶底物法進行銅綠假單胞菌的測定，重復(fù)進行6次測定。將結(jié)果與定量質(zhì)控的真值范圍進行比較，所有6組結(jié)果均在定量質(zhì)控的真值范圍內(nèi)，合格率為100%。為進一步評價酶底物法檢測銅綠假單胞菌結(jié)果的正確度，將檢測結(jié)果作對數(shù)處理使其滿足正態(tài)分布后，再進行方法正確度的計算。結(jié)果表明：方法正確度相對誤差為0.8%，說明酶底物法測定銅綠假單胞菌的結(jié)果非?？煽?、準(zhǔn)確。
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考慮到熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌和銅綠假單胞菌均為假單胞菌屬，而大腸埃希氏菌菌株在市場上普遍存在，較為容易購買，所以選擇熒光假單胞菌（CICC 21620）、惡臭假單胞菌（CICC 20544）和大腸埃希氏菌（CICC 23657）3種菌株作為銅綠假單胞菌的陰性菌進行排他性試驗。
按照廠家說明書將標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇傳代后，將其配置成濃度為1×103-105CFU/250mL的菌懸液，隨后使用酶底物法進行檢測，每種菌的每個濃度測定3次，3個濃度共計測定9次，所有孔格在培養(yǎng)24h后均未出現(xiàn)熒光，測定結(jié)果均為陰性。說明酶底物法測定銅綠假單胞菌同樣具備很高的特異性。
?。ㄋ模┘訕?biāo)水樣與濾膜法的比較
使用銅綠假單胞菌有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（NCTC 12951），制備成高、中、低3種濃度的人為污染水樣，其范圍分別為：低（濃度為1-10MPN/250mL）、中（濃度為50-100MPN/250mL）和高（濃度為500-1500MPN/250mL），用酶底物法（T/HBFIA 0026—2021）和濾膜法（GB 8538—2016） 對其進行檢測，其中低濃度36組，中濃度50組，高濃度33組。為進一步探究兩種方法在檢測樣品時是否存在差異性，運用SPSS Statistics軟件對濾膜法和酶底物法的3組檢測結(jié)果進行t檢驗分析，為了使檢測結(jié)果呈正態(tài)分布，將檢測結(jié)果作對數(shù)處理后再進行t檢驗分析，低濃度濾膜法和酶底物法中的t檢驗P=0.203（＞0.05），中濃度濾膜法和酶底物法中的t檢驗P=0.253（>0.05），高濃度濾膜法和酶底物法中的t檢驗P=0.228（＞0.05），說明兩種檢測方法的3種不同濃度檢測結(jié)果無顯著差異，具有高度一致性。可認(rèn)為濾膜法和酶底物法均可有效檢測包裝飲用水中的銅綠假單胞菌。
?。ㄎ澹┟傅孜锓ㄅc濾膜法綜合比較
從培養(yǎng)基、檢測周期、結(jié)果讀數(shù)、操作步驟等方面對兩種檢驗方法進行了綜合比較分析。濾膜法測定包裝飲用水中銅綠假單胞菌所需用到的培養(yǎng)基和試劑包括CN瓊脂、金氏培養(yǎng)基、乙酰胺肉湯、營養(yǎng)瓊脂、氧化酶制劑和納氏試劑，其中乙酰胺具有刺激性且可致癌、納氏試劑中的碘化汞同樣為劇毒藥品，培養(yǎng)基和試劑成分對人體的危害較大，酶底物法所用培養(yǎng)基和試劑基本為無毒。同時，酶底物法可以直接在24h內(nèi)出結(jié)果，無需確認(rèn)實驗，而濾膜法的檢測周期則需要48h—7d，檢測步驟也相對較為復(fù)雜。從結(jié)果讀數(shù)來講，酶底物法可直接通過365nm紫外燈判讀所有發(fā)熒光的孔格，判斷為銅綠假單胞菌的陽性，而濾膜法則需要人為進行菌落計數(shù)，誤差相對較大。由此可見，酶底物法在檢驗周期、培養(yǎng)基、操作過程等方面較濾膜法有明顯優(yōu)勢。
三、結(jié)論
酶底物法測定包裝飲用水中銅綠假單胞菌在國內(nèi)外都有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證，具有操作便捷、檢測周期短、無需確認(rèn)實驗、結(jié)果讀數(shù)簡單等特點，可以作為濾膜法的一個很好補充。特別是在檢測大批量樣品或者應(yīng)急檢測時，較濾膜法有非常大的優(yōu)勢。作為濾膜法的補充，酶底物法將成為一種發(fā)展趨勢，未來有可能替代濾膜法，成為主流的包裝飲用水中銅綠假單胞菌測定方法?！?/span>（王 靜）
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選擇NSI銅綠假單胞菌定量質(zhì)控（批號：210414，真值范圍168±24MPN/250mL），使用酶底物法進行銅綠假單胞菌的測定，重復(fù)進行6次測定。將結(jié)果與定量質(zhì)控的真值范圍進行比較，所有6組結(jié)果均在定量質(zhì)控的真值范圍內(nèi)，合格率為100%。為進一步評價酶底物法檢測銅綠假單胞菌結(jié)果的正確度，將檢測結(jié)果作對數(shù)處理使其滿足正態(tài)分布后，再進行方法正確度的計算。結(jié)果表明：方法正確度相對誤差為0.8%，說明酶底物法測定銅綠假單胞菌的結(jié)果非?？煽?、準(zhǔn)確。
?。ㄈ┡潘栽囼?/span>
考慮到熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌和銅綠假單胞菌均為假單胞菌屬，而大腸埃希氏菌菌株在市場上普遍存在，較為容易購買，所以選擇熒光假單胞菌（CICC 21620）、惡臭假單胞菌（CICC 20544）和大腸埃希氏菌（CICC 23657）3種菌株作為銅綠假單胞菌的陰性菌進行排他性試驗。
按照廠家說明書將標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇傳代后，將其配置成濃度為1×103-105CFU/250mL的菌懸液，隨后使用酶底物法進行檢測，每種菌的每個濃度測定3次，3個濃度共計測定9次，所有孔格在培養(yǎng)24h后均未出現(xiàn)熒光，測定結(jié)果均為陰性。說明酶底物法測定銅綠假單胞菌同樣具備很高的特異性。
?。ㄋ模┘訕?biāo)水樣與濾膜法的比較
使用銅綠假單胞菌有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（NCTC 12951），制備成高、中、低3種濃度的人為污染水樣，其范圍分別為：低（濃度為1-10MPN/250mL）、中（濃度為50-100MPN/250mL）和高（濃度為500-1500MPN/250mL），用酶底物法（T/HBFIA 0026—2021）和濾膜法（GB 8538—2016） 對其進行檢測，其中低濃度36組，中濃度50組，高濃度33組。為進一步探究兩種方法在檢測樣品時是否存在差異性，運用SPSS Statistics軟件對濾膜法和酶底物法的3組檢測結(jié)果進行t檢驗分析，為了使檢測結(jié)果呈正態(tài)分布，將檢測結(jié)果作對數(shù)處理后再進行t檢驗分析，低濃度濾膜法和酶底物法中的t檢驗P=0.203（＞0.05），中濃度濾膜法和酶底物法中的t檢驗P=0.253（>0.05），高濃度濾膜法和酶底物法中的t檢驗P=0.228（＞0.05），說明兩種檢測方法的3種不同濃度檢測結(jié)果無顯著差異，具有高度一致性。可認(rèn)為濾膜法和酶底物法均可有效檢測包裝飲用水中的銅綠假單胞菌。
?。ㄎ澹┟傅孜锓ㄅc濾膜法綜合比較
從培養(yǎng)基、檢測周期、結(jié)果讀數(shù)、操作步驟等方面對兩種檢驗方法進行了綜合比較分析。濾膜法測定包裝飲用水中銅綠假單胞菌所需用到的培養(yǎng)基和試劑包括CN瓊脂、金氏培養(yǎng)基、乙酰胺肉湯、營養(yǎng)瓊脂、氧化酶制劑和納氏試劑，其中乙酰胺具有刺激性且可致癌、納氏試劑中的碘化汞同樣為劇毒藥品，培養(yǎng)基和試劑成分對人體的危害較大，酶底物法所用培養(yǎng)基和試劑基本為無毒。同時，酶底物法可以直接在24h內(nèi)出結(jié)果，無需確認(rèn)實驗，而濾膜法的檢測周期則需要48h—7d，檢測步驟也相對較為復(fù)雜。從結(jié)果讀數(shù)來講，酶底物法可直接通過365nm紫外燈判讀所有發(fā)熒光的孔格，判斷為銅綠假單胞菌的陽性，而濾膜法則需要人為進行菌落計數(shù)，誤差相對較大。由此可見，酶底物法在檢驗周期、培養(yǎng)基、操作過程等方面較濾膜法有明顯優(yōu)勢。
三、結(jié)論
酶底物法測定包裝飲用水中銅綠假單胞菌在國內(nèi)外都有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證，具有操作便捷、檢測周期短、無需確認(rèn)實驗、結(jié)果讀數(shù)簡單等特點，可以作為濾膜法的一個很好補充。特別是在檢測大批量樣品或者應(yīng)急檢測時，較濾膜法有非常大的優(yōu)勢。作為濾膜法的補充，酶底物法將成為一種發(fā)展趨勢，未來有可能替代濾膜法，成為主流的包裝飲用水中銅綠假單胞菌測定方法?！?/span>（王 靜）
